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铜绿假单胞菌整合子与多重耐药性研究
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【摘要】 目的 在铜绿假单胞菌中检测1类整合子并分析整合子对细菌耐药性的影响。 方法 用VITEK-AMS 微生物自动分析仪鉴定细菌和药敏试验，用PCR方法扩增I类整合酶基因，经电泳后检测扩增产物。 结果 158株铜绿假单胞菌中检测出1类整合子42株，检出率为26.6%。1类整合子阳性菌对氨基糖苷类、喹诺酮类及头孢菌素类药物表现出较高的耐药率。携带1类整合子菌株易表现出对至少4种抗菌素的多重耐药性，其多重耐药率为68.6%(33/48)，明显高于1类整合子阴性菌株(28.6%)，P<0.05。 结论 1类整合子广泛存在铜绿假单胞菌中,1类整合子对细菌多重耐药性的产生和传播起着重要作用，应加强临床细菌基因水平的耐药监测，采取有效措施防止耐药性的传播。
【关键词】 铜绿假单胞菌 整合子 多重耐药
铜绿假单胞菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。随着抗生素的广泛使用和不合理使用，使包括铜绿假单胞菌在内的多种细菌的耐药性问题日益严重。
整合子是与细菌耐药性传播有关的基因系统，整合子通过捕捉和整合细菌耐药基因，在细菌耐药性的传播和扩散中起了重要的作用。整合子通过位点特异性的基因重组可整合多种耐药基因对细菌多重耐药的形成起着重要作用职称论文。
本文对158株铜绿假单胞菌进行分析，以探讨铜绿假单胞菌整合子与其多重耐药性之间的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
2009年10月～2010年5月从我院临床标本中分离的铜绿假单胞菌158株。标本分别来自老年病房(53株)、呼吸科病房(49株)、普外科病房(28株)、泌尿科病房(16株)和内分泌病房(12株)。菌株分别分离自痰标本(68株)、脓汁(42株)、咽拭子(18株)、尿标本(12株)、伤口分泌物(10株)和血液(8株)。标准质控菌株为铜绿假单胞菌(ATCC27853)。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。
1.1.2 鉴定卡片
全自动微生物分析仪(VITEK-AMS)采用的GNI鉴定卡、GNS药敏卡均购自法国Biomerievx公司,GNS药敏卡包括氨苄青霉素、庆大霉素、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、复方新诺明、头孢噻肟、亚胺培南11种抗菌药物职称论文。
1.1.3 PCR试剂
TaqDNA聚合酶,4种dNTP混合液,DNA分子标准参照物购自Takara公司;琼脂糖,溴化乙啶等常用分子生物学试剂购自上海生工公司。
1.1.4 主要仪器
VITEK-AMS自动鉴定系统购自法国Biomerievx公司;PCR扩增仪、DNA/RNA/protein analyzer分析仪和高速低温离心机购自德国eppendorf公司;PCR电泳仪为北京崇文东方仪器厂产品;DGW-99型台式高速微型离心机为宁波新芝科器研究所产品。
1.2实验方法
1.2.1 菌株鉴定
所有菌株都用VITEK AMS 分析仪GNI细菌鉴定卡进行菌种鉴定。体外药物敏感试验：采用GNS检测卡测定13种抗菌药物对158株铜绿假单胞菌的MIC值，操作方法按照VITEK AMS规定的方法进行。
1.2.2加热裂解法制备DNA模板
:用Luria-Bertani液体培养基200r/min振荡培养8h获得对数生长期菌株。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。
1.2.3筛选1型整合子阳性菌株
用PCR方法扩增整合子可变区，以整合子上游引物ggcatccaagcagcaagc和整合子可变区下游引物aagcagacttgacctgat，进行PCR扩增。50ulPCR反应体系为:DNA100ng、25mmol/LMgCl2、0.4mmol/LdNTP、0.4pmol/L引物和2.5UTaq酶。PCR反应循环参数设置如下94℃预变性4分钟;94℃45秒，55℃，45秒，72℃3分钟，循环35次;最后72℃延伸10分钟。
1.2.4 PCR反应结束后取产物琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下拍照记录结果。
1.2.5 统计学处理
采用χ2检验，P<0.05有显著差异。统计软件为SPSS10.0。
2 结果
2.1 1类整合子基因检测结果
全部158株铜绿假单胞菌的DNA上有42株检测到I类整合子，占细菌总数的26.6%。1类整合子的大小分别为600bp、1000bp、1600bp、1900bp和2100bp。根据各株细菌质粒DNA上检测到1类整合子的大小和数目，细菌质粒NDA上的整合子可分为5种整合子谱。
2.2 1类整合子阳性菌株与耐药性的关系
对比1类整合子阳性菌株与阴性菌株对抗菌药物的耐药率，并做统计分析，结果见表1。
1类整合子阴性菌株对11种抗菌药物完全敏感率为54.4%(86/158)。1类整合子阳性菌株更易表现出对青霉素、喹诺酮类、磺胺类药物的耐药。耐药率最高的是复方新诺明(100%)其次为氨苄青霉素(90.5%)和庆大霉素(85.7%)，丁胺卡那也表现出较高的耐药率(76.7%)。1类整合子阳性菌株对6种药物的耐药率显著高于阴性菌株，P<0.05。
2.3 1类整合子与多重耐药率的相关性
多重耐药率(耐4种以上抗生素)为62.0%(98/158)，其中1类整合子阳性菌株多重耐药率占85.7%(36/42)，阴性菌株多重耐药率为20.7%(24/116)。1类整合子阳性菌株多重耐药率明显高于阴性株，差异有统计学意义(χ2=18.23，P<0.01)。
3 讨论
整合子是存在于细菌质粒、染色体或转座子上的一种遗传结构，可以捕获耐药基因，使细菌表现为对抗生素的多重耐药[1]给临床治疗带来极大的困难。整合子本身不能移动，但常作为转座子的一部分或借助可移动性质粒在同种细菌或不同种细菌间播散，造成细菌耐药性的扩大，是细菌多重耐药迅速发展的重要原因。根据整合酶的不同分为6 类[2]在临床分离的菌株中以 1类合子最为常见。1类整合子基本结构由三部分组成,两端为高度保守的序列，分别称作5’CS和3’CS,5’CS和3’CS之间为可变区，可变区由一个或多个外来插入的基因盒组成[3]。在整合酶的催化下.通过位点重组系统整合外来耐药基因，使耐药基因得到不断的累积，从而使细菌具有耐药性和多重耐药性。目前在1类整合子中发现的基因盒已超过80种，大部分是耐药基因盒，编码产物可赋予细菌对几乎全部临床抗生素耐药。
铜绿假单胞菌作为医院感染的重要的条件致病菌，在长期应用激素、免疫抑制剂，进行肿瘤化疗、放射治疗等导致病人免疫功能低下，以及手术后或某些治疗操作后的病人易导致本菌感染，该菌常常具有多重耐药的特点，因此其所造成的感染难以治愈，病死率高。而近年证实整合子介导的多重耐药基因也是造成铜绿假单胞菌多重耐药的主要原因之一[4]。
本研究显示，铜绿假单胞菌在呼吸道的感染占首位为54.5%(86/158)，这与大多数文献的报导相符合[5]究其原因，可能与铜绿假单胞菌容易定植于呼吸道，且由于气管插管、流感病毒感染及其他各种炎症等因素损害了呼吸道黏膜，在鞭毛或蛋白酶作用下，细菌易于移生、粘附有关。伤口创面也较易受其侵害，检出率32.9%(52/158)，居第二位，与其存在广泛及医院环境的隔离消毒程度关系颇大。实验证明，我院患者分离的铜绿假单胞菌对多种抗生素出现高耐药，尤其是表现出对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、单环β-内酰胺类以及磺胺类等的多重耐药性，更是不容忽视。
研究表明1型整合子在铜绿假单胞菌耐药性产生的遗传机制上起着重要作用，它是引起细菌多重耐药的重要因素。由于抗生素使用量和种类日趋增多，使细菌生存面临更大的抗生素选择压力。本次研究客观反映了我院铜绿假单胞菌的整合子携带情况，分析本次结果发现在158株铜绿假单胞菌中检出42株整合子阳性，检出率为26.6%，与其他报道铜绿假单胞菌整合子检出率不完全相同[6]，这可能是由于地域的不同所造成的，也可能与菌株的来源有关。整合子阳性的细菌表现出多重耐药性比整合子阴性菌高，证实了整合子介导了多重耐药性产生。但由于铜绿假单胞菌耐药机制比较复杂，耐药性还与抗菌药物作用的靶位改变、OprD蛋白缺失引起的菌膜通透性下降、菌体细胞膜上主动外排泵系统的上调以及产生B一内酰胺酶等机制有关，对于铜绿假单胞菌的耐药机制还有待于进一步研究，以采取有效措施控制其耐药性传播。抗生素的使用越广泛，使携带新耐药基因的优势菌越多，并导致携带耐药基因菌群量更大，为1类整合子多重耐药细菌提供了选择性压力，可能使其耐药种类更多，传播更广泛。因此，这种耐药机制引起的细菌耐药应该引起临床的足够重视，加大监测力度，预防医院感染的发生。
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