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消栓口服液化学成分的变化论文
摘要：目的：检测原工艺、发酵离心工艺、发酵醇沉工艺制备的消栓口服液中主要成分的含量变化。方法：采用HPLC法，以色谱峰面积为指标，比较不同制备工艺消栓口服液中黄芪甲苷、芍药苷、阿魏酸的含量变化。结果：发酵后黄芪甲苷的含量比原工艺组增加，而芍药苷和阿魏酸的含量减少。结论：不同工艺制备的消栓口服液主要化学成分的含量有所不同，微生物发酵技术可以为中药的开发利用提供新的思路。
关键词：消栓口服液；发酵；含量测定
消栓口服液为临床常用中药，它是在补阳还五汤的基础上研制的新剂型，具有补气活血、通络化瘀等功效。主治气虚血瘀引起的后遗症之半身不遂，口眼歪斜，言语不清，口角流涎，小便频数，下肢痿废，苔白脉缓以及脉络阻滞之疑难杂症[1]。消栓口服液是由黄芪、赤芍、川芎、当归、地龙、桃仁、红花7味药组成。方中重用黄芪补气，与活血化瘀药配伍，具有益气活血的功效，用以治疗气虚血瘀型中风[2]，具有良好的临床效果[3]。发酵是传统中药加工炮制的重要方法之一[4]，发酵中药借助微生物的作用，改变了中药原有药性，其主要特点就是发生了生物转化[5]。因此将微生物发酵技术引入中药，也就是将药材与辅料拌和，在一定温度和湿度下，通过微生物发酵可以达到提高药效、节约资源、降低毒副作用等目的[6]。目前，中草药发酵的研究已从单味药涉及到复方研究，并取得了显著成果[7]。本文对不同工艺制备的消栓口服液中3种主要成分进行含量测定，为消栓口服液的临床用药以及发酵中药的发展提供科学依据。
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent1200series高效液相色谱仪，AlltechSD2000蒸发光散射检测器（美国安捷伦）等。
1.2试药与试剂
黄芪甲苷对照品（批号：110781-200613）、芍药苷对照品（批号：110736-200526）、阿魏酸对照品（批号：110773-200611），均购于中国药品生物制品鉴定所；消栓口服液、发酵离心工艺消栓口服液、发酵醇沉工艺消栓口服液，均由济南三株集团医药生物研究所提供；甲醇、乙腈为色谱纯；磷酸、醋酸等试剂均为国产分析纯；哇哈哈纯净水等。
2含量测定的方法与结果
2.1样品溶液的制备
2.1.1消栓口服液原工艺样品的制备分别精密称取黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、桃仁、红花7味药，加水煎煮2次，第1次1.5h，第2次为1h，合并煎液。滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.18~1.22（50℃），加乙醇使含醇量为75%，静置，取上清液，回收乙醇，浓缩药液至120mL[8]，加蔗糖54g，加热溶解，放冷，滤过，加苯甲酸钠0.9g，加水稀释至300mL，混匀，灌封，灭菌，即得[9]。2.1.2消栓口服液发酵后离心样品的制备分别精密称取上述7味药，同法煎煮，合并煎液。滤过，滤液减压浓缩至合适体积，配料，调pH，灭菌，接种噬酸乳杆菌、植物乳杆菌、短双歧杆菌，37℃培养24h，稳定化处理，离心，定容至750mL，分装，灭菌，即得。2.1.3消栓口服液发酵后醇沉样品的制备分别精密称取上述7味药，同法煎煮，合并煎液。滤过，滤液减压浓缩至合适体积，配料，调pH，灭菌，接种噬酸乳杆菌、植物乳杆菌、短双歧杆菌，37℃培养24h，减压浓缩至相对密度为1.18~1.22（50℃），加乙醇使含醇量为75%，静置，取上清液，回收乙醇，浓缩药液至适量，加蔗糖0.09g，溶解，放冷，滤过，加苯甲酸钠0.9g，加水稀释至300mL，混匀，分装，灭菌，即得。
2.2对照品溶液的制备
2.2.1黄芪甲苷对照品溶液的制备取五氧化二磷减压干燥24h的黄芪甲苷对照品适量，精密称定。加甲醇制成每1mL含0.6260mg的对照品溶液[10]。2.2.2芍药苷对照品溶液的制备取五氧化二磷减压干燥36h的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芍药苷0.232mg的对照品溶液。2.2.3阿魏酸对照品溶液的制备取五氧化二磷减压干燥24h的阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL溶液含阿魏酸0.108mg的对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备
2.3.1黄芪甲苷供试品溶液的制备精密量取3种工艺消栓口服液各20mL，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次30mL，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为测定黄芪甲苷的供试品[11]。2.3.2芍药苷供试品溶液的配置精密量取3种工艺消栓口服液各2mL，蒸干，加甲醇定容至25mL，超声30min，放至常温，补足损失甲醇，取续滤液，0.45μm滤膜滤过，作为测定芍药苷的供试品[12]。2.3.3阿魏酸供试品溶液的配置精密量取3种工艺消栓口服液各25mL，加甲醇75mL，超声20min，蒸干，用甲醇溶解，定容到10mL，过0.45μm滤膜，作为测定阿魏酸的供试品[13]。
2.4黄芪甲苷的含量测定
2.4.1色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6mm×250mm，5μm），乙腈-水（32∶68）为流动相，流速：1mLmin-1，蒸发光散射检测器，漂移管温度105℃，气体流量3.0Lmin-1，柱温25℃[14]。2.4.2线性关系考察精密量取黄芪甲苷对照品溶液，分别将5、10、15、20、25μL注入液相色谱仪中，按照“2.4.1”项下色谱条件测定峰面积积分值。以黄芪甲苷的峰面积对数（Y）为纵坐标，以进样量的对数（X）为横坐标，进行线性回归，求得回归方程为Y=1.4303X+2.1451，R=0.9992，结果表明，黄芪甲苷在3.13~15.65μg进样量的对数与峰面积的对数呈良好的线性关系。2.4.3方法学考察（1）精密度试验：吸取上述对照品溶液适量，按照上述色谱条件测定，连续进样6次，测得黄芪甲苷峰面积，经计算其RSD=1.63%（n=6），表明精密度良好。（2）稳定性试验：取消栓口服液的样品供试液，按照上述色谱条件分别于0、2、4、8、12、24h测定，结果黄芪甲苷RSD=1.53%（n=6）。表明供试品在24h内稳定性良好。（3）重复性试验：取同一批原工艺消栓口服液，按上述方法平行制备6份并测定黄芪甲苷含量，结果平均含量为0.1844mgmL-1，RSD=1.75%。（4）加样回收试验：取已测知黄芪甲苷含量（0.1844mgmL-1）的消栓口服液8mL，分别加黄芪甲苷对照品2.4mL（相当于黄芪甲苷1.5024mg），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，分别精密吸取对照品溶液5、10μL，供试品溶液10μL，注入液相色谱仪中，测定黄芪甲苷峰面积积分值，计算黄芪甲苷平均回收率。结果显示，黄芪甲苷的平均加样回收率为99.27%，RSD为1.46%。2.4.4含量测定分别取不同工艺消栓口服液各3批，按上述方法制备供试液并测定，每批连续进样3次，以外标两点法计算样品中黄芪甲苷含量。2.4.5高效液相色谱图见图1~图2。
2.5芍药苷的含量测定
2.5.1色谱条件色谱柱：依利特HypersilODS2（4.6mm×150mm，5μm），流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（20∶80），流速：1.0mLmin-1，柱温：25℃；检测波长：芍药苷230nm，进样量：20μL[15]。2.5.2线性关系的考察取芍药苷对照品溶液（0.2320mgmL-1），分别用甲醇配成0.2320、0.1160、0.0773、0.0464、0.0258mgmL-1的系列对照品溶液，取20μL注入液相色谱，用上述色谱条件测定，记录峰面积，以芍药苷对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，Y=28329X-11.7483，R=0.9994，表明芍药苷在4.64~0.5165μg线性范围内峰面积与浓度的量呈良好线性关系。2.5.3方法学考察（1）精密度试验：取浓度为0.232mgmL-1的芍药苷对照品溶液，重复进样6次，测定其峰面积，结果RSD为1.35%，表明精密度良好。（2）稳定性试验：取同一供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、16、24h进样测定，RSD=1.42%（n=6），表明在24h内测定结果稳定。（3）重复性试验：取同一供试品溶液，按照“2.3”项下方法平行制备6份，按照上述方法测定，RSD=1.60%，表明重复性较好。（4）加样回收试验：取原工艺消栓口服液2mL，加芍药苷对照品11.25mL（相当于芍药苷2.61mg），按照“2.3”项下方法制备供试品并测定，计算芍药苷平均回收率。结果，芍药苷的平均加样回收率为99.65%，RSD为1.81%。2.5.4含量测定取不同工艺消栓口服液各3批，按照“2.3”项下方法制备供试品并测定，分别精密吸取20μL，每批连续进样3次，测定峰面积，计算样品中芍药苷含2.5.5高效液相色谱图
2.6阿魏酸的含量测定
2.6.1色谱条件色谱柱：依利特HypersilODSC18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-1%醋酸水溶液；流速：1.0mLmin-1；柱温：25℃；检测波长：阿魏酸320nm；进样量：20μL[16]。2.6.2线性关系的考察取阿魏酸对照品溶液（0.108mgmL-1），分别用甲醇配成0.036、0.0154、0.0098、0.0072、0.0057mgmL-1的系列对照品溶液，按“2.6.1”项下色谱条件进样，每次进样20μL，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为：Y=94920X-81.2，R=0.9995。结果表明阿魏酸在0.114~0.72μg范围内呈良好线性关系。2.6.3方法学考察（1）精密度试验：取浓度为0.108mgmL-1的阿魏酸对照品溶液，每次进样量20μL，重复进样6次，测定其峰面积积分值，经计算其相对标准偏差RSD的值为1.17%。（2）稳定性试验：取原工艺消栓服液适量，按照“2.3”项下方法制备，分别于0、2、4、8、12、24h进样测定，每次进样量20μL，测定阿魏酸峰面积积分值，其相对标准偏差RSD值为1.22%（n=6）。结果表明，供试品在24h内稳定性良好。（3）重复性试验：取同一批原工艺消栓口服液，按照“2.3”项下方法平行制备6份，注入液相色谱仪，每次进样20μL，测定阿魏酸峰面积积分值。阿魏酸的平均含量为0.0112mgmL-1，RSD为1.30%，结果表明重复性良好。（4）加样回收试验：取原工艺消栓口服液10mL，加阿魏酸对照品1mL（相当于阿魏酸0.108mg），按“2.3”项下方法制备供试品并测定，计算回收率，平均回收率为99.23%，RSD为1.57。2.6.4含量测定取3批原工艺消栓口服液，按照“2.3”项方法制备供试品并测定，计算样品中阿魏酸含量。2.6.5高效液相色谱图见图5~图6。2.7结果从表1可以看出，黄芪甲苷的含量发酵前后比较是原工艺组最低，发酵离心组和发酵醇沉组都有些增高，而芍药苷和阿魏酸正好相反，由于在消栓口服液中主要有效成分是黄芪甲苷，所以说可以进行适量发酵。
3讨论
本文对不同制备工艺的消栓口服液中的黄芪甲苷、芍药苷、阿魏酸的含量进行了测定。含量测定方法参考有关权威文献，采用高效液相色谱法，通过对流动相的选择、检测波长的确定、线性范围、精密度、回收率等研究确定了最佳的检测条件。结果显示黄芪甲苷经发酵后含量稍高于原工艺组，说明发酵后可能有些成分转换为黄芪甲苷[17]，相反芍药苷和阿魏酸经发酵后的含量低于原工艺组，可能芍药苷和阿魏酸经过发酵后会分解或转换[18]，因此黄芪甲苷、芍药苷和阿魏酸等主要成分的含量变化有待进一步研究。本文将发酵技术应用于中药复方制剂的制备工艺，提高了中药复方制剂的质控标准，从而保证了药物的临床疗效[19]。该研究也为中药开发研究提供了新的思路，具有很好的社会和经济效益，为今后发酵中药的临床应用提供科学依据并奠定坚实的基础[20]。
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