注射用鹿瓜多肽细菌内毒素检查方法

时间：2022-10-06 01:28:17 药学毕业论文我要投稿

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注射用鹿瓜多肽细菌内毒素检查方法

　　注射用鹿瓜多肽细菌内毒素检查方法【1】

　　[摘要]目的研究注射用鹿瓜多肽对细菌内毒素检查实验的干扰情况,并建立其细菌内毒素检查的质量标准。

　　方法参照《中国药典》2005年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法进行试验,用二个不同厂家的鲎试剂对注射用鹿瓜多肽进行干扰试验研究。

　　结果注射用鹿瓜多肽稀释成≥ 25倍时对细菌内毒素检查无干扰作用。

　　结论用细菌内毒素检查法(凝胶法)检测注射用鹿瓜多肽热原是可行的。

　　[关键词]细菌内毒素; 注射用鹿瓜多肽; 鲎试剂

　　注射用鹿瓜多肽为注射用无菌粉末,常用于静脉滴注,现标准规定用热原法检查 ,但其影响因素多,检验成本大,耗时长。

　　为此,笔者探讨注射用鹿瓜多肽的细菌内毒素检查法,来代替热原检查法,其实验方法如下。

　　1仪器与试剂

　　1.1样品注射用鹿瓜多肽批号:20091152、20091046、20090935,规格8mg ,生产企业:黑龙江迪龙制药有限公司; 注射用鹿瓜多肽批号090622、090714、090806,规格8mg, 生产企业:黑龙江江世药业有限公司。

　　1.2 试剂细菌内毒素工作标准品(批号:150601-200965,规格180EU/ml,中国药品生物

　　制品检定所);鲎试剂(TAL):灵敏度0.25EU/ml,批号1002090, 湛江博康海洋生物有限公司; 0.25EU/ml 090416,湛江安度斯生物有限公司;细菌内毒素检查用水(BET水),内毒素≤0.003EU/ml,批号W2008 04, 中国药品生物制品检定所)

　　1.3 仪器:ZH-2型旋涡混匀器;101-3型电热恒温干燥箱; ET-96型内毒素凝胶法测定仪。

　　2方法与结果

　　2.1热原检查按热原检查法[1]操作,以上所取各生产企业的每批样品热原检查均符合规定。

　　2.2TAL标示灵敏度(λb)复核按细菌内毒素检查法[2]操作,各批TAL灵敏度标示符合规定。

　　2.3限值(L)的确定[2]按公式L=K/M确定,注射剂K为5EU/(kg・h);注射用鹿瓜多肽最大注射剂量为每次24mg,按60kg成人标准体重,1h最快给药速度计算,即:L=K/M=12.5EU/mg

　　2.4注射用鹿瓜多肽细菌内毒素限值为12.5EU/mg,对应灵敏度0.5～0.03 EU/ml的鲎试剂,按公式计算,对应的有效稀释倍数分别为25倍、50倍、100倍、200倍。

　　2.5取注射用鹿瓜多肽样品,用BET水稀释成1:25、1:50、1:100、1:200、倍系列浓度,记此系列溶液为Sw;另制备同样稀释倍数并含有2λ浓度内毒素系列的样品溶液,记此系列溶液为SE。

　　选择两个鲎试剂生产企业,灵敏度均为λ=0.25EU/ml的TAL,分别与SW和SE两个系列稀释液反应,依次记为NPC和PPC,正式进行注射用鹿瓜多肽干扰试验预试验,试验重复2管,另分别设PC、NC管各2支,分别做阳性和阴性对照。

　　结果见表1。

　　对另一厂家3个批号的注射用鹿瓜多肽的干扰试验预试验,都得出以上相同结论,因此可初步确定注射用鹿瓜多肽的最小不干扰稀释倍数为25倍,可在此浓度下进行干扰验证试验。

　　2.6干扰试验从预试验结果可知, 注射用鹿瓜多肽在稀释到50倍时可排除干扰,以细菌内毒素检查用水及注射用鹿瓜多肽50倍的稀释液,分别将细菌内毒素工作标准品配成浓度为2.0λb,1.0λb,0.5λb,0.25λb4个浓度的溶液(分别称X系列和Y系列),同时两个系列分别以细菌内毒素检查用水和注射用鹿瓜多肽50倍的稀释液作阴性对照(NC)。

　　以两个不同企业,灵敏度均为0.25EU/ml的TAL,进行干扰试验[2]。

　　结果见表2。

　　结果表明注射用鹿瓜多肽稀释50倍后,消除了对鲎试剂与细菌内毒素反应的抑制作用。

　　供试品的λ值均在0.5～2.0λb(0.125～0.5 EU/ml)

　　因此,在进行该品种的细菌内毒素检查时可选用的鲎试剂最大的灵敏度:λ= 0.125EU/ml。

　　同时,用以上方法和试剂对注射用鹿瓜多肽100倍的稀释液进行干扰验证,其结果为Et=Es=λb,证明无干扰。

　　2.7 注射用鹿瓜多细菌内毒素检查按《中国药典》2005年版二部附录XIE中细菌内素素检查法,使用二批不同厂家的鲎试剂分别对样品进行细菌内毒素检查,并同时设立样品的自身对照管,结果见表3

　　3讨论

　　注射用鹿瓜多肽对鲎试剂与细菌内毒素的反应无干扰作用。

　　干扰试验结果证实, 注射用鹿瓜多肽在稀释倍数≥25倍时,对灵敏度在0.5～2.0λb(0.125～0.5 EU/ml)的鲎试剂无干扰作用,因此注射用鹿瓜多肽用细菌内毒素检查法是可行的。

　　按细菌内毒素检查法[2]进行检查,每1mg本品中含细菌内毒素量应小于12.5EU/mg。

　　参考文献

　　[1] 国家药典委员会.中国药典2005版二部附录ⅪD・北京:化学工业出版社,2005.85.

　　[2] 国家药典委员会.中国药典2005版二部附录ⅪE・北京:化学工业出版社,2005.85.

　　[3] 刘婉.注射用更昔洛韦细菌内毒素检查法的实验研究[J].中国实用医药2008, 3(27): 69-71.

　　[4] 张云平,陈启钊. 注射用血栓通细菌内毒素检查方法的探讨[J]. 中国药师, 2010,13(3).

　　注射用盐酸格拉斯琼氯化钠细菌内毒素检查方法【2】

　　【摘要】目的研究用细菌内毒素检查方法替代鲎试剂法。

　　方法对药厂生产的注射用盐酸格拉斯琼氯化钠采用试剂检查细菌内毒素。

　　结果细菌内毒素检查的方法比鲎试剂动物检查的方法更安全、灵敏。

　　结论用该方法使结果更安全、准确。

　　【关键词】格拉斯琼氯化钠;细菌内毒素;动物实验

　　1 一般资料

　　注射用盐酸格拉司琼氯化钠， (新疆制药厂生产，批号：06120621、06120631、06121641)， (热源检查均符合规定)，规格：50ml/瓶：注射用盐酸格拉司琼(以 C18H24N4O计)3mg与氯化钠。

　　鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，批号： 06120521、06120621、06120631，规格：0.1ml/支，灵敏度：0.25EU/ml。

　　)细菌内毒素标准品：由中国药品生物制品检定所，批号：2006-10，效价：160EU/A，细菌内毒素检查用水(BET水)：湛江博康海洋生物有限公司生产，批号：0603182，规格50ml/瓶。

　　2 方法与结果

　　2. 1 鲎试剂灵敏度复核，按《中国药典》[1]2005年版细菌内毒素检查方法的要求：结果，鲎试剂的灵敏度复核规定均在(0.5～2.0)λ之间符合规定。

　　表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果。

　　由表 1 可见3批鲎试剂均在(0.5～2.0)λ之间，由此鲎试剂灵敏度均符合规定，可见于细菌内毒素检查，标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

　　2. 2 供试品内毒素限值(L)的确定，《中国药典》[1]2005版二部附录采用细菌内毒素检查方法，根据公式 L=K/M 确定供试品的内毒素限值。

　　式中L为供试品的细菌内毒素的限值，以EU/ml考虑到合并用药因素，供试品细菌内毒素限值 L为0.25EU/ml。

　　2. 3 供试品最大有效稀释倍数的确定，采用公式 MVD=CL/λ确定供试品最大不干扰浓度。

　　根据公式MVD=CL/λ，选用市售鲎试剂灵敏度标示值为0.25 EU/ml。

　　来确定供试品注射用格拉斯琼氯化钠的最大不干扰浓度MVD=CL/λ=2 。

　　2. 4 干扰预试验，细菌内毒素检查用水对供试品2倍的稀释，取供试品(原液)及1：2稀释的供试品溶液，将细菌内毒素工作标准品逐一稀释，稀释的倍数是1倍、2倍、4倍、8倍、把结果设立阴性和阳性的对照，并且做阴、阳性对照(各2管)，表明原液对鲎试剂有干扰，供试品稀释后对鲎试剂试验无任何干扰。

　　见表2。

　　2. 5 供试品干扰试验，用两个厂家的灵敏度为0.25EU/mg，制成细菌内毒素标准品分别含内毒素(2.0、 1.0、 0.5、0.25)λ浓度的溶液。

　　分别平行做4管，并且做细菌内毒素检查用水和供试品的溶液为(1：2)分别做2管比较，并计算以样品稀释液配制的细菌内毒素溶液反应到终点浓度几何均值(Et)观察结果，表明ES在(0.5～2.0)λ之间， Et在(0.5 s～2.0) Es之间，表明该注射液的2倍稀释液对鲎试剂试验没有产生干扰作用。

　　供试品的细菌内毒素取三批注射用盐酸格拉斯琼依次加入细菌内毒素检查用水制成每1ml中含格拉斯琼30μg的溶液，按《中国药典》2005年版检查法进检查，每1ml中含内毒素的量应(﹥0.25EU)。

　　见表3。

　　表 3供试品干扰试验结果。

　　3 讨论

　　本文主要通过干扰试验预试验，取3批注射用盐酸格拉斯琼氯化钠溶液2倍稀释液对细菌内毒素检查无干扰。

　　用细菌内毒素检查法代替热原检查法是合理的，表明用细菌内毒素检查方法控制内毒素的方法是可行的。

　　参考文献

　　[1] 国家要点委员.中华人民共和国药典(二部).2005年版、北京：化学工业出版社， 2005.

　　注射用葛根素的细菌内毒素检查法可行性【3】

　　[摘要] 目的:对注射用葛根素进行凝胶法干扰试验,建立注射用葛根素的细菌内毒素检查试验方法。

　　方法:采用《中国药典》2005年版二部附录收载的细菌内毒素检查法。

　　结果:注射用葛根素稀释至浓度1.5 mg/ml时对细菌内毒素检查法无干扰作用。

　　结论:使用细菌内毒素检查法检查注射用葛根素中的细菌内毒素是可行的,可用细菌内毒素检查法代替家兔热原检查法。

　　[关键词] 注射用葛根素;细菌内毒素;凝胶法;干扰试验

　　葛根素是从豆科植物野葛干燥根中提取的单体,为异黄酮类化合物,临床及基础研究证明,该药具有扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收缩功能、促进血液循环等药理作用[1-2],临床上现已用于治疗心脑血管及外周血管疾病[3-4]。

　　该品种国家药品标准WS1-(X-388-1)-2003Z进行热原检查[5],未进行细菌内毒素检查。

　　为考察该品种是否可以用细菌内毒素检查法来代替热原检查法,本文参照《中国药典》2005年版二部附录收载的细菌内毒素检查法对注射用葛根素进行了细菌内毒素检查研究。

　　1 仪器与试药

　　注射用葛根素(批号:08020301,规格:0.2 g/瓶,华北制药集团制剂有限公司;批号:20061222,200712131,规格:100 mg/瓶,北京赛生药业有限公司;批号:20060522,200711303,规格:50 mg/瓶,北京赛生药业有限公司;批号:07102801,规格:0.4 g/瓶,山东瑞阳制药有限公司;批号:07121101,规格:0.2 g/瓶,山东瑞阳制药有限公司;批号:07100401, 规格:0.1 g/瓶,山东瑞阳制药有限公司;批号:07091602,规格:50 mg/瓶,山东瑞阳制药有限公司);鲎试剂(批号:0807022,规格:0.1 ml/支,标示灵敏度:0.25 EU/ml,湛江安度斯生物有限公司;批号:080506, 081012,规格:0.1 ml/支,标示灵敏度:0.25 EU/ml,厦门市鲎试剂实验厂有限公司鲎试剂);细菌内毒素工作标准品(批号:150601-200860,规格:160 EU/支,中国药品生物制品检定所);细菌内毒素检查用水(批号:0801180,规格:50 ml/支,湛江安度斯生物有限公司);漩涡振荡器(IKA-MS-1);恒温水浴箱(德国Julabo 19A)。

　　2 方法与结果

　　2.1 鲎试剂标示灵敏度的复核[6-7]

　　根据鲎试剂灵敏度的标示值,将细菌内毒素工作标准品用BET水溶解,在漩涡振荡器上混匀15 min,然后制成2.00λ、1.00λ、0.50λ和0.25λ 4个浓度的内毒素标准溶液,按《中国药典》2005年版二部附录的细菌内毒素检查法规定,对湛江安度斯生物有限公司和厦门市鲎试剂实验厂有限公司两个厂家的鲎试剂进行灵敏度的复核,鲎试剂灵敏度的测定值(λc)=lg-1(∑X/4),式中X为反应终点浓度的对数值(lg),结果见表1。

　　3批鲎试剂灵敏度分别为0.25 EU/ml、0.25 EU/ml和0.42 EU/ml,均在0.5 λ～2.0 λ范围之间,表明3批鲎试剂灵敏度均符合规定,可用于细菌内毒素检查。

　　表 1 鲎试剂灵敏度复核结果

　　Tab.1 The results of tachypleus amebocyte lysate sensitivity test

　　2.2 注射用葛根素的细菌内毒素限值(L)的确定[6-7]

　　按《中国药典》2005年版二部中细菌内毒素检查法的规定确定细菌内毒素限值。

　　根据公式L=K/M,式中L为供试品的细菌内毒素限值,K为按规定的给药途径,人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,注射剂K=5 EU/(kg・h),M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量,人均体重按60 kg计算,注射时间若不足1 h,按1 h计算。

　　从注射用葛根素的产品使用说明书可知本品的最大用药剂量为600 mg,人均体重以60 kg计,滴注时间按1 h计算, 则M=600 mg/60 kg・h=10 mg/(kg・h),L= K/M =[5 EU/(kg・h)]/[10 mg/(kg・h)]=0.5 EU/mg。

　　本品为心血管药、儿童老人用药,根据《注射剂安全性检查法应用指导原则(修订稿)》的要求安全系数定为3,本品内毒素最终确定限值为L=0.17 EU/mg。

　　2.3 注射用葛根素的干扰预试验稀释倍数的确定[8-9]

　　目前用于药品检验的市售鲎试剂灵敏度(λ)一般在0.50～0.03 EU/mg范围内,最小有效稀释浓度c=λ/L,L=0.17 EU/mg,故注射用葛根素进行细菌内毒素检测时,0.50～0.03 EU/mg的鲎试剂相对应的最小有效稀释浓度为3.00、1.50、0.75、0.38、0.18 mg/ml。

　　2.4 干扰预试验试验[8-9]

　　取3批注射用葛根素(批号:08020301,规格:0.2 g/瓶;批号:200711303,规格:50 mg/瓶;批号:07121101,规格:0.2 g/瓶)各1瓶,分别加BET水适量溶解,制成50 mg/ml的供试品原液,用BET水将供试品原液进行倍比稀释,制得3.00、1.50、0.75、0.38、0.18 mg/ml共5个浓度梯度的溶液,将此系列浓度溶液标记为供试品管(NPC系列),用上述稀释液作为溶剂,溶解并稀释细菌内毒素工作标准品,制得每个稀释度中细菌内毒素含量均为2 λ(0.5 EU/ml)的注射用葛根素溶液,标记此系列溶液为供试品阳性对照管(PPC系列)。

　　取灵敏度为0.25 EU/ml的湛江安度斯生物有限公司和厦门市鲎试剂实验厂有限公司两个不同厂家的鲎试剂进行试验,每一稀释度做2管,同时按常规分别设细菌内毒素阳性对照(PC)和检查用水阴性对照(NC)各2管,结果见表2。

　　表 2 注射用葛根素干扰预试验结果

　　Tab.2 The results of prerliminary interference test of

　　Puerarin for Injection

　　由表2结果可知,所用的3批注射用葛根素稀释到3.0 mg/ml浓度的溶液时,有2批样品对湛江安度斯生物有限公司的鲎试剂与细菌内毒素反应有干扰作用,稀释到1.5 mg/ml或以下浓度的溶液时,对两个厂家的鲎试剂与细菌内毒素反应无增强或抑制的干扰作用。

　　2.5 干扰试验[6-7]

　　用两个厂家的鲎试剂(灵敏度为0.25 EU/ml),按《中国药典》2005年版二部附录的细菌内毒素检查法进行试验,测定用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et)。

　　取3批注射用葛根素(批号:08020301,200711303,07121101)各1瓶,分别加BET水适量溶解,制成50 mg/ml的供试品原液,再用BET水稀释制成浓度为1.5 mg/ml的供试品稀释液,用BET水和供试品稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释成2.00 λ、1.00 λ、0.50 λ、0.25 λ浓度的BET水系列细菌内毒素溶液和供试品稀释液系列细菌内毒素溶液,每一稀释浓度重复4管,同时用上述供试品稀释液和BET水各做2管阴性对照管,按公式计算BET水和供试品稀释液反应终点浓度的几何平均值(Es和Et),Es=lg-1(∑Xs/4),Et=lg-1(∑Xt/4),结果见表3。

　　表 3 注射用葛根素的正式干扰试验结果

　　Tab.3 The results of interference test of Puerarin for Injection

　　由表3结果可知,2 λ管均为阳性,0.50 λ、0.25 λ管均为阴性,对于λ=0.25 EU/ml的2组鲎试剂的Es分别为0.25 EU/ml、0.35 EU/ml,Es均在0.5λ～2.0 λ范围内,3批注射用葛根素测得的Et均在0.5 λ～2.0 λ范围内,Et和Es的比值在0.5～2.0范围内,说明注射用葛根素在1.5 mg/ml或以下浓度的溶液对两个不同厂家的鲎试剂与内毒素的反应无增强或抑制的干扰作用,符合《中国药典》2005年版二部对细菌内毒素检查有效性的规定,因此可以确定注射用葛根素的最大无干扰浓度为1.5 mg/ml。

　　2.6 注射用葛根素的细菌内毒素检查

　　取9批注射用葛根素样品,分别根据“2.5”项下方法制成供试品稀释液,使用λ=0.25 EU/ml的两个厂家的鲎试剂进行细菌内毒素检查,并用此稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释为2 λ的溶液,作为供试品的阳性对照,另外以细菌内毒素检查用水建立阳性对照和阴性对照。

　　按《中国药典》2005年版二部细菌内毒素检查法检查,结果见表4。

　　由表4结果可知,阴性对照管(NC)均为阴性,供试品阳性对照管(PPC)和阳性对照管(PC)均为阳性,实验有效;供试品管(NPC)均为阴性,表明样品中未检出细菌内毒素,9批注射用葛根素的细菌内毒素检查均符合规定。

　　3 结论

　　3.1 无干扰浓度确定

　　干扰试验目的是评价样品浓度对鲎试剂与内毒素凝集反应的干扰程度及干扰性质,初步筛选出对细菌内毒素检查无干扰的样品浓度范围。

　　本品通过将注射用葛根素稀释至1.5 mg/ml或以下浓度,消除对鲎试剂凝集反应的干扰。

　　3.2 鲎试剂的影响

　　不同厂家的鲎试剂由于生产工艺、质量参数等方面有一定差异,其抗干扰能力存在差异。

　　因此,本实验采用2个不同厂家的鲎试剂对3个批号的样品进行实验。

　　从正式干扰试验结果可见,样品稀释至1.5 mg/ml浓度时,Es或Et均在0.5 λ～2.0 λ范围之内,可认为注射用葛根素在该浓度下不干扰细胞内毒素检查。