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多酚氧化酶的研究现状
论文摘要：多酚氧化酶被认为是导致酶促褐变反应的主要因素，对其的研究也在逐步深入。文章结合多酚氧化酶的结构特性、催化机理、活性影响因素、生理功能、活性测定和分离纯化等方面的内容，对多酚氧化酶的研究现状进行了综述。
论文关键词：多酚氧化酶(PPO);催化机理;生理功能
多酚氧化酶 (polyphenol oxidase，PPO)属核编码含铜金属酶，广泛存在于植物、真菌、昆虫等机体中。它可分为酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶、漆酶等三大类，由于其能有效催化多酚类化合物氧化形成相应的醌类物质，因此被认为是导致酶促褐变反应的主要因素。早在1937年Kubowitz就在Warburg实验室中第一次分离得到了多酚氧化酶[2，3]。随着研究的不断深入，对多酚氧化酶各方面的认识也在不断加深，本文就多酚氧化酶的结构特性、催化机理、生理作用等方面做简要的介绍。
一、多酚氧化酶PPO的结构特性
PPO是一种含有Cu2+离子的结构蛋白，可以催化酚类上的羟基，使之转化为醌或催化多酚类变为氧合醌。因为醌类具有较强的电化学性质，会发生自动氧化、蛋白质的亲核聚合反应及一些二级反应，而这些反应都会导致酶促褐变反应的发生。植物中的PPO包括一些由核编码的，多基因的家族。在蕃茄中，已有几个PPO的基因被分离出来，并从结构上将其分为三组。在马铃薯中，有4条独立的cDNA被克隆，每一个都显示了独特的空间图景。在扁豆中，有三条与PPO有关的cDNA克隆已被建立。所有的PPO基因都有两个区域，一是与Cu有关的编码区，另一个是引导肽(transitpeptide)，以便能进入质体。PPO的前体(含有引导肽的)约60-75KDa，而成熟的PPO(去除了引导肽的有活性的形式)约45-69 KDa，由于这种潜在的酶活性的存在，使PPO活性的问题研究起来十分复杂。未激活的PPO可被陈化作用、加盐、去污剂(如SDS)、蛋白酶切或尿素的加入等激活。
二、PPO的催化机理
多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PPO)是从真菌到植物乃至哺乳动物体内都广泛存在的一类铜蛋白，它能有效催化多酚类化合物氧化形成相应的醒类物质。在茶儿茶素氧化PPO底物儿茶素(catechin)类能和许多金属离子络合，Cu2+离子形成的配位物中的配位数为4或6，可以从配位体的配位键来阐明PPO的催化生化机理。PPO的多肽链通过自身的折叠卷曲，形成具有一定构象的高级结构。Cu2+与多肽链上的氨基酸残基以配位键相连，主要有His-His和Cys-His残基作为铜离子的配基，形成具有特定立体结构的活性部位。当邻苯二酚基和底物存在时，由于其“靠近”及“定向”效应，使多肽链和底物的空间构象发生改变，相互契合，从而使底物进入活性中心，邻苯二酚基上的二个羟基与多肽链上的氨基酸残基以氢键相连，形成酶与底物的复合物，由于复合物的不稳定性，多肽链构象发生扭曲，氢键断裂，H被附着在多肽链上，酶与底物不再契合，两者都同时发生构象转变，于是产物脱离了活性部位，成为邻醌。邻醌可发生一系列次生氧化作用，形成了多种氧化产物。酶又通过脱氢作用，发生构象回转，恢复以前的天然构象，重新成为具有催化能力的蛋白质。
三、PPO的生理功能
高等植物组织发生褐变主要是PPO活动的结果。PPO催化单酚羟基化为邻二酚，二羟酚氧化为邻醌。醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，结果发生黑色或褐色色素沉淀，最终导致水果、蔬菜等经济作物营养丢失和经济损失。
PPO作为一种氧化还原酶还在光合作用中发挥作用。如调节叶绿体中有害的光氧化反应速度，参与其中电子传递;PPO还可促进伤口的愈合，也可增加植物对病原体的抗性。如烟草对炭疽病、黄瓜对黑星病、苹果对轮纹病、棉苗对枯萎病菌、水稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病以及番茄对小昆虫的抗性等。PPO的作用方式有：
1.如番茄的具腺毛状体中含有大量PPO，PPO具有存在于表皮中、活化态和可溶性的特性，在毛状体介导的抗病过程中起作用[12]。
2.通过醌共价调节亲核氨基酸形成抗营养机制，直接抵御昆虫和病原体[13]。
3.醌的毒性直接发挥抗病作用。
4.如番茄中PPO克隆的反义表达可对基因家族的各成员进行负调节，对病原体产生超敏感性(感受性过敏)[14]。
5.邻醌的次生反应所产生的黑色素的痂可阻止感染的扩散[15]。
PPO与水果和作物的褐变有关，为了防止水果褐变保持水果的新鲜性，生产上运用多种方法来降低水果中的PPO含量，例如涂以抗坏血酸、柠檬酸为主剂的复合护色剂，杏用沸水烫4min基本控制PPO活性，对莱阳梨进行套袋抑制PPO活性等。
四、PPO活性影响因素
随着诱导剂特性的不同，PPO的分子特性如分子量、等电点等都有所改变。生长培养基的成分也可部分地控制PPO酶产量，例如：硫酸铵抑制PPO形成，而谷氨酸促进PPO形成。在植物组织中激活剂可打破PPO的潜伏状态。在蚕豆中PPO可被游离脂肪酸酸化激活，菠菜类囊体中分离出来的PPO可被亚麻酸激活。这表明PPO的天然激活剂确实存在。同样PPO的天然抑制剂也存在，例如菠菜叶中的草酸盐，茶叶中的橡黄素、白花青素等。矿物质营养例如钙或磷的缺乏可导致PPO活性的降低;硼缺乏对单子叶植物无影响，但可导致双子叶植物中PPO活性的增加。植物正常新陈代谢受到干扰也会导致PPO活性的改变：例如贮存时通风不好或生长时水分不够均可引起PPO水平的升高。铜是PPO的组成部分，铜缺失时苜蓿叶片不能表现出PPO酶活性，即使后来再补充铜也不行，这说明全酶只能在发育的早期形成。
钟瑾等[16]用自制壳聚糖与戊二醛交联对PPO固定化进行了初步探讨，表明当戊二醛浓度为2%时，酶活力最高，并提出在确定给酶量时，要兼顾酶活和回收率二者的影响以达到最佳。李荣林等[17]应用海藻酸钠和戊二醛交联法对PPO进行包埋取得了成功，并对其性质进行了系统研究发现[18]：将酶的最适pH上移至7.0，最适温度上升至40℃，酶对金属离子的适应性增强，对抑制剂敏感性下降，低温贮存下，半衰期由3个月上升到221天。
五、PPO活性的测定方法
测定多酚氧化酶活性的方法有：检压法、极谱电极法、比色法、碘量滴定法等[19]。最早是将酚或邻苯二酚作为底物用滴定法来测定多酚氧化酶活性，后来发现用极谱电极法测定O2消耗更精确一些[20]。但是，无论是滴定法还是极谱电极法都必须经过种子研磨的过程，为了测定的省时方便， Kruger[21]首创了无须研磨种子就可以测出小麦多酚氧化酶活性的方法:种子在水中浸泡16h，然后加入邻苯二酚，反应30min后用动态的微盘计数器测溶液的颜色变化。将这种方法与研磨种子氧电极法比较，相关系数为0. 85。伴随着科技的发展和分光光度计的应用， Anderson[22]将整粒种子测定方法做了进一步改进: 3～5个整籽粒或0.4g被钳碎的种子放入离心管中，加入用50mM MOPS缓冲液配制的L-DO-PA，室温振荡反应30min或37℃振摇5min后过滤，然后在分光光度计下测定475nm吸收值，这种方法与研磨种子氧电极法比较，相关系数为0.86。
六、PPO的分离纯化
PPO通常以不溶状态存在，为使其以可溶形式从完整细胞或组织结构中释放出来，并保持其活性和稳定性，通常要进行充分的细胞破碎，释放出细胞的内含物，经匀浆提取后可得粗酶制剂。为了减少对细胞活动的影响，需尽量去模拟细胞体内的环境，如适宜的pH(5.6)、温度(37℃)等。如茶叶中存在大量的多酚类物质，因此在该酶的分离提纯过程中要加入多酚吸附剂，如聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)等以清除多酚。
多酚氧化酶的分离提纯方法有冷丙酮法和匀浆法二种方法。须海荣 [23]研究指出：冷丙酮法效果较差，酶活较低，可能跟丙酮引起酶蛋白不可逆变性有关，但其操作相对而言较为方便。随着酶提取技术的发展，匀浆法逐步得以完善，首先它在酶的提取过程中能最大限度地保留酶的活性，其次能去除多酚氧化酶提取中的一些杂蛋白以及过氧化物酶等一些酶蛋白的影响。再采取硫酸铵分级沉淀，凝胶色谱等技术，以达到纯化目的。
七、应用前景
调节PPO表达是未来研究热点，一方面因为受伤或衰老会导致黑色素的形成，负调节PPO能大量提高作物的质量;另一方面PPO的过度表达能减少害虫对作物的侵害，或通过影响植物蛋白形成抗营养机制，或在毛状体渗出液中通过它启动聚合作用捕获昆虫。因此负调节PPO表达或调节PPO使其过度表达在生产及应用方面都具有很好的前景及重要的实际意义。
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