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叶下珠复方Ⅱ号对小鼠实验性肝损伤的保护作用
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【摘要】 观察叶下珠复方Ⅱ号对小鼠实验性肝损伤的保护作用。【方法】将NIH小鼠随机分成正常对照组，模型组，叶下珠复方Ⅱ号高、中、低剂量组(剂量分别为110、55、27.5g·kg-1)，联苯双酯组(150mg·kg-1);以刀豆蛋白A(Con A)和D?氨基半乳糖(D?GalN)分别复制小鼠急性肝损伤模型，用叶下珠复方II号水提液进行干预治疗，并与联苯双酯进行对照，检测小鼠血清谷丙转氨酶( ALT)、谷草转氨酶(AST)及肝组织超氧化物歧化酶(SOD)活性，并观察肝组织病理改变。【结果】叶下珠复方Ⅱ号可显著性降低两种实验性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性，升高肝损伤小鼠肝组织SOD活性，与模型组比较差异有显著性意义(P<0.01)，与联苯双酯组比较差异无显著性意义(P>0.05)，且可明显减轻肝组织病理改变。 【结论】 叶下珠复方Ⅱ号对刀豆蛋白A和D?氨基半乳糖所致小鼠实验性肝损伤具有较好的保护作用，作用机制与抑制脂质过氧化损伤有关。
【关键词】 叶下珠复方Ⅱ号/药理学 肝损伤/中药疗法 肝/病理学 疾病模型 动物 小鼠
叶下珠复方Ⅱ号是在叶下珠复方[1]的基础上加入桃仁、苦参等药物组方而成，具有解毒活血、疏肝健脾作用，临床上主要用于慢性乙型肝炎和肝纤维化的治疗。为探讨该复方对实验性肝损伤保护作用的效果，我们以NIH小鼠为实验对象，观察该方对刀豆蛋白A(Con A)所致免疫性肝损伤模型和D?氨基半乳糖(D?GalN)所致化学性肝损伤模型的作用，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物 NIH小鼠，雌雄各半，体质量18～22g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK(粤)2003-0001。
1.2 药物 叶下珠复方Ⅱ号组方药材购于广州中医药大学第一附属医院，水煎2次，混合后浓缩成含生药4kg/L，用时以蒸馏水配成所需浓度;联苯双酯滴丸由北京协和制药厂生产，批号04060106，每丸含联苯双酯7.5mg，试验时以30g/L的二甲基亚砜溶解，再用蒸馏水稀释至所需浓度;刀豆蛋白A(Con A)为美国华盛顿生物药品公司产品;D?氨基半乳糖(D?GalN)由重庆医科大学生化教研室生产，批号050326。
1.3 主要试剂与仪器 谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒均由上海荣盛生物技术有限公司提供，批号为20050125;超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号20041108;722型分光光度计(上海第三分析仪器厂);TLL?C台式冷冻离心机(北京四环科学仪器厂); CK40?F200型显微镜(Olympus Optical Co.Ltd)。
1.4 ConA致小鼠急性肝损伤模型复制及分组、给药方法[2] 将60只NIH小鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，叶下珠复方Ⅱ号高、中、低剂量组(简称中药高、中、低剂量组，剂量分别为110、55、27.5g·kg-1，相当于20倍、10倍和5倍临床用药剂量)，联苯双酯(150mg·kg-1)治疗组。除正常对照组外，其他各组小鼠于实验首日上午尾静脉注射ConA20mg·kg-1，各给药组于首日、次日和第3日上午予小鼠灌胃给药1次;末次给药后4h，模型组和各给药组小鼠再次尾静脉注射ConA20mg·kg-1，禁食不禁水，8h后摘眼球取血，分离血清待检;断头处死动物，取肝左叶组织，一部分用体积分数为40%甲醛溶液固定，另一部分制成匀浆待检。
1.5 D?GalN致小鼠急性肝损伤模型的复制及分组、给药方法[3] 分组和剂量设计同1.4，各治疗组小鼠每日灌胃给药1次，连续4d。末次给药后1h，除正常对照组外，其他组小鼠均以D?GalN 800mg·kg-1腹腔注射，禁食不禁水，24h后摘眼球取血，分离血清待检;断头处死动物，取肝左叶组织，一部分用体积分数为40%甲醛溶液固定，另一部分制成匀浆待检。
1.6 血浆ALT、AST活性检测 采用赖氏法，按试剂盒说明操作，采用722型紫外分光光度计于波长505nm处检测吸光值,制定标准曲线,换算成ALT、AST值。
1.7 肝组织SOD活性测定 将肝组织制成100g/L匀浆，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，按试剂盒说明操作。
1.8 组织病理学观察 以体积分数为40%甲醛溶液固定肝组织, 石蜡包埋切片，常规苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察、拍照。
1.9 统计学方法 采用SPSS10.0软件包进行统计分析,多组计量资料分析采用One?way ANOVA法,多重比较采用LSD法。
2 结果
2.1 叶下珠复方Ⅱ号对Con A致小鼠急性肝损伤模型的保护作用 由表1可知，模型组小鼠血清ALT、AST活性较正常对照组升高，肝组织SOD活性较正常对照组降低，差异均有显著性意义(P<0.01)。中药高、中、低剂量组ALT、AST活性均低于模型组，差异有显著性意义(P<0.01)，而与联苯双酯组比较，差异无显著性意义(P>0.05)。中药高、中、低剂量组肝组织中SOD的活性高于模型组，差异有显著性意义(P <0.01)， 但与联苯双酯组比较，差异无显著性意义(P>0.05)。
肝组织病理学观察：光镜下见正常对照组肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝窦未见异常。模型组全部小鼠肝组织均出现明显病变，小叶内大多数肝细胞肿胀，细胞质疏松化，有的呈气球样变，可见凋亡小体、明显的点状坏死和灶性坏死，坏死灶可见大量炎性细胞浸润;汇管区淋巴细胞和单核细胞炎性浸润尤为明显,肝窦内可见红细胞淤积。叶下珠复方Ⅱ号高、中剂量组和联苯双酯组部分肝组织可见散在点状坏死和灶性坏死，肝细胞损伤程度明显减轻，炎性细胞浸润显著减少(图1)。
2.2 叶下珠复方Ⅱ号对D?GalN致小鼠急性肝损伤模型的保护作用 由表2可知，模型组小鼠血清ALT、AST活性较正常对照组升高，肝组织SOD活性较正常组降低，差异均有显著性意义(P<0.01)。除中药低剂量组血清ALT外，中药各组血清ALT、AST活性降低，肝组织SOD活性升高，与模型组比较有显著性差异(均P <0.01)，与联苯双酯组比较差异无显著性意义(P>0.05)。
肝脏组织病理学观察：光镜下见正常对照组肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶结构完整，无病理性改变。模型组全部小鼠肝组织均出现病变，大多数肝细胞肿胀，细胞质疏松化，有的呈气球样变，可见广泛的肝细胞脂肪变性、点状坏死和灶性坏死，并出现炎性细胞浸润。叶下珠复方Ⅱ号高、中剂量组和联苯双酯组肝细胞变性、坏死程度显著减轻，炎性细胞浸润减少,肝组织病变明显改善(图2)。表1 叶下珠复方Ⅱ号对Con A致肝损伤小鼠血清ALT、AST及肝组织SOD活性的影响表2 叶下珠复方Ⅱ号对D?GalN所致肝损伤小鼠血清ALT、AST及肝组织SOD活性的影响
3 讨论
Con A是一种被广泛应用的可活化T细胞的有丝分裂原，ConA诱导的小鼠免疫性肝损伤模型，被认为更适合研究人类病毒性肝炎和自身免疫性肝病的病理机制和进行抗肝损伤的药物筛选[4 -5]。ConA活化TH细胞后刺激TH细胞和巨噬细胞共同产生过量的干扰素γ(IFN?γ)和肿瘤坏死因子(TNF?α)等细胞因子，已证实TNF?α为细胞因子网络中介导肝损伤的终末介质，它既是肝细胞凋亡的正性触发因子,可直接损伤血管内皮细胞，亦可活化中性粒细胞促进其趋化聚集于肝脏，释放蛋白酶或氧自由基引起肝细胞凋亡或坏死[6-7]。
D?GalN所致中毒性肝损伤模型的肝组织病理学和生化改变与人类病毒性肝炎相似，是评价保肝药物效果和研究其作用机理的经典动物模型之一。以往认为D?氨基半乳糖氨引起的肝细胞损伤的机制是D?GalN在肝细胞内与尿苷二磷酸(UDP)结合，形成UDP?半乳糖氨复合物，使尿苷三磷酸(UTP)耗竭、尿苷类化合物环化不能进行，致使RNA和蛋白质合成受阻，最终导致肝细胞坏死[8]。近年的研究表明，D?GalN可引起肝细胞内钙离子增多，镁离子减少，钙离子增多则抑制线粒体的呼吸功能，激活磷脂酶，分解膜磷脂，破坏溶酶体膜，使蛋白水解酶释放，并使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，加速氧自由基的产生，引发脂质过氧化反应，破坏肝细胞膜结构，造成胞浆内可溶性酶如转氨酶等渗入血液而活性升高，使肝细胞损伤进一步加剧[9-10] 。
SOD是氧自由基的清除剂，可抑制自由基启动的脂质过氧化反应，肝细胞受到自由基攻击时，SOD可因其过度消耗而减少，SOD活力的高低间接反映了机体清除自由基和抗组织过氧化损伤的能力[11] 。
本实验采用Con A致免疫性肝损伤和D?GalN致化学性肝损伤两种动物模型，观察叶下珠复方Ⅱ号的抗肝损伤作用效果，结果表明叶下珠复方Ⅱ号可显著性降低两种实验性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性，升高肝损伤小鼠肝组织SOD活性，与模型组比较差异有显著性意义(P<0.01)，与联苯双酯组比较差异无显著性意义(P>0.05)，且可明显减轻肝组织病理变化。提示叶下珠复方Ⅱ号具有较好的降酶保肝作用，其作用可能与增强机体抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制脂质过氧化损伤有关，确切机制有待进一步深入研究。
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