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利用HPLC-FLD对大鼠5-HT含量测定实验分析的药学本科毕业论文
1 仪器和试剂
美国Waters高效液相色谱仪（ 510泵， 474荧光检测器， 717自动进样器及柱温控箱等）；Empower色谱数据工作站；瑞士Mettler万分之一、十万分之一及百万分之一电子天平；美国Milli-Q纯水器；三洋MDF-382E超低温冰箱，Beckman 21R高速冷冻离心机，上海金达生化仪器厂XUF-1高速分散器。
5-羟色胺（5-HT）标准品（1357359 33907213 美国Fluka公司）；甲醇为江苏汉邦科技有限公司的色谱纯甲醇；其它试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 色谱条件色谱柱为Alltima C18（4.6 mm×250 mm,5 μm），流动相为0.1 mol/l磷酸二氢钾溶液-甲醇（9∶1 V/V）；单泵等度洗脱；流速1.0 ml/min，；λEx:254 nm；λEm:338 nm；柱温：35℃。
2.2 标准品溶液的配制精密称取5-HT标准品适量，用0.1 mol/L盐酸制成0.35 mg/ml的对照品贮备液，避光冷藏保存。按实际检测需要，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释到相应的溶度，供检测用。
2.3 大鼠海马脑组织匀浆样品的制备取大鼠海马组织，称湿重，以1∶10的比例加入0.4 mol/L的高氯酸，（即每100 mg脑组织加1 ml 0.4 mol/L的高氯酸）。冰浴下充分匀浆，冰浴沉淀30 min，于4℃，10 000 r·min-1离心15min，取上清液，每毫升上清液加0.75 ml 4%的碳酸氢钠溶液、混匀后，于4℃、3 000 r·min-1离心5 min，取上清液，过0.45 μm滤膜，分装，于-80℃保存待用。
3 结果
3.1 标准液和样品液的色谱分离图在选定的色谱条件下，标准品液与按“2.3”项下方法处理的样品分别进样的色谱图见图1～2，从图中可知，5-HT 峰形良好，无杂质峰干扰，其保留时间为9.9 min。
3.2 线性范围、检出限采用外标法，取0.7 μg·ml-1的5-HT标准液在选定的色谱条件下分别进样1，3，6，9，12 μl，以峰面积Y为纵坐标、进样量X（ng）为横坐标作图，检测线性范围为0.70～8.40 ng（r=0.999 9）；峰面积与进样量呈良好的线性关系；以信噪比为 3（S/N =3）时，计算检出限为1.27×10-3 ng。
3.3 精密度、重复性实验在上述色谱条件下，取浓度为0.7 μg·ml-15-HT的标准液，重复测定5次，测得日内精密度相对标准偏差（RSD）为0.7%，表明实验方法精密度良好。
取同一样品平行5份，按“2.3”项下方法处理，在上述色谱条件下，连续进样5次，考察样品峰面积的重复性，结果相对标准偏差（RSD）为2.8%。表明实验方法具有很好的重复性。
测定方法选择本文对5-HT含量检测比较了高效液相-电化学（HPLC-ECD）和HPLC-FLD，发现应用HPLC-ECD方法时，检测器对流动相的改变较敏感，使系统不易稳定。最终选择了高效液相分析中高分辨率，高灵敏度的荧光检测法。建立了适用于检测5-HT物质简单、快速、重复性好的HPLC-FLD。在探索该测定方法时，作者观察到海马组织样品的处理要快，制备好的待测样品要保存在-80℃冰箱内，这对得到良好的分析结果至关重要。
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